安全有效地全身遞送mRNA到體內(nèi)特定器官和細胞仍然是開發(fā)基于mRNA的療法的主要挑戰(zhàn)。與mRNA共配制的系統(tǒng)給藥脂質(zhì)納米顆粒（LNP）的靶向主要局限于肝臟和脾臟。

這里的一些研究來源于許巧兵教授團隊，使用文庫篩選方法，發(fā)現(xiàn)N系列LNPs（尾部含有酰胺鍵）能夠選擇性地將mRNA遞送到小鼠肺，發(fā)現(xiàn)O系列LNPs（尾部含有酯鍵）傾向于將mRNA遞送到肝臟， 發(fā)現(xiàn)基于咪唑的LNPs優(yōu)先將mRNA靶向脾臟。并使用液相色譜-質(zhì)譜分析了肝和肺靶向LNPs上的蛋白冠，并鑒定了一組獨特的血漿蛋白，這些蛋白質(zhì)特異性地吸附在表面，可能有助于這些LNPs的靶向性。通過簡單地調(diào)整N系列LNPs的頭部結(jié)構(gòu)，也可以靶向不同的肺細胞類型。

重要的是，這里證明了基于LNP的RNA治療在淋巴管平滑肌瘤?。↙AM）的臨床前模型中的成功，LAM是一種由Tsc2基因功能喪失突變引起的破壞性肺部疾病。肺靶向LNP高效遞送小鼠結(jié)節(jié)性硬化復合物2（Tsc2）mRNA用于修復腫瘤中的TSC2抑癌基因，并在減輕腫瘤負荷方面取得了顯著的治療效果。確立了mRNA LNPs作為治療LAM的有前景的治療干預措施。

由于mRNA主要在全身遞送后積聚在肝臟和脾臟中，迄今為止，大部分臨床興趣都集中在肝臟疾病上。迫切需要能夠?qū)⑻禺愋詍RNA遞送到肝外組織的遞送載體，以充分發(fā)揮基于mRNA的治療的潛力。目前已經(jīng)做出了相當大的努力來開發(fā)器官靶向LNPs，通過用肽、抗體和蛋白質(zhì)等靶向部分修飾LNPs的表面來繞過肝臟積累。

10.1021/acschembio.0c00003開發(fā)了用α血漿囊泡相關(guān)蛋白抗體功能化的靶向LNP，用于體內(nèi)肺靶向mRNA遞送。10.1038/s41565-020-0669-6開發(fā)了一種選擇性器官靶向（SORT）策略，以設(shè)計和調(diào)整LNP的生物分布，摻入額外的賦形劑SORT分子可以精確改變體內(nèi)mRNA遞送曲線。

這些策略在減輕肝臟積累和將mRNA輸送到肺或脾臟方面表現(xiàn)出優(yōu)勢。這些有希望的發(fā)展激勵研究人員繼續(xù)探索將mRNA遞送到特定位置的創(chuàng)新方法。

對于類脂尾部化學，盡管在了解脂質(zhì)尾長、不飽和度和支化度對mRNA遞送效力的影響方面取得了相當大的進展，但類脂尾部結(jié)構(gòu)對LNP體內(nèi)選擇性的影響仍然知之甚少。為了解決這一重要的知識空白，通過胺頭和丙烯酰胺尾之間的邁克爾(Michael)加成反應(yīng)合成了一個含酰胺鍵的脂質(zhì)（N系列LNPs）庫（圖1 A）。通過體內(nèi)篩選，發(fā)現(xiàn)N系列LNPs在全身給藥后幾乎只將mRNA遞送到肺部（圖1 B和C）。尾部含有酯鍵的O系列LNPs傾向于將mRNA遞送到肝臟中（圖2A）。使用蛋白質(zhì)組學，鑒定了一組獨特的血漿蛋白，這些蛋白特異性地吸附在兩個代表性的LNP候選物306-O12B和306-N16B的表面，這可能會影響這些LNPs的靶向性。更重要的是，通過改變N系列LNPs的脂質(zhì)頭部結(jié)構(gòu)可以靶向不同的肺細胞亞群。

●圖1  N系列LNPs的合成和體內(nèi)篩選。（A）類脂質(zhì)的合成路線和代表性化學結(jié)構(gòu)。通過IVIS成像系統(tǒng)測量的小鼠的代表性全身生物發(fā)光圖像（B）和N系列LNP的體內(nèi)mRNA遞送效率（C）。小鼠以0.5mg / kg的單劑量注射Luc mRNA負載的N系列LNP中的任何一種。在注射后6h（n = 3）拍攝圖像。

●圖2  O系列LNPs的合成和體內(nèi)篩選。(A)尾部分枝生物還原類脂的化學結(jié)構(gòu)。(B)給藥后6h，Balb/c小鼠(n=3)測定可生物還原LNPs與MC3 LNP的熒光素酶生物發(fā)光強度。配方：LNP/膽固醇/DSPC/DMG-PEG=50/38.5/10/1.5（摩爾比），LNP/mRNA=12.5/1(重量比)。(C)用DLS法測量由fLuc mRNA形成的306-O12B LNPs的大小和分布。

N系列LNPs的合成和mRNA負載LNPs的體內(nèi)篩選

使用無溶劑邁克爾加成反應(yīng)將丙烯酰胺尾部（N16B、N14B和N12B）與不同的胺頭反應(yīng)，從而生成了9種可生物還原的N系列類脂（圖1A）。然后將LNPs與用先前優(yōu)化的LNP配方進行配制，用于mRNA遞送，其中摩爾比是50%合成的LNPs、38.5%膽固醇、10% DOPC和1.5% DMG-PEG2000。為了研究這些LNPs在體內(nèi)的全身性mRNA遞送情況，包裹編碼螢火蟲熒光素酶的螢火蟲熒光素酶mRNA（fLuc mRNA），螢火蟲熒光素酶是一種可以使用IVIS成像系統(tǒng)（Perkin-Elmer）在體內(nèi)可視化的報告蛋白。有趣的是，N系列LNPs處理小鼠的生物發(fā)光信號主要位于肺部（圖1B）。

此外，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)的化學結(jié)構(gòu)在決定所配制的LNPs的體內(nèi)mRNA遞送效率中起著關(guān)鍵作用。如圖1C所示，注射后6 h肺部熒光素酶生物發(fā)光強度的定量表明，與304和113 LNPs相比，306胺頭摻入的LNPs表現(xiàn)出最高的遞送效率。遞送效率也隨著類脂質(zhì)尾長的增加而提高，與具有N14B或N12B尾部的脂質(zhì)相比，具有N16B尾部的脂質(zhì)表現(xiàn)出最高的效率。為了研究輔助脂質(zhì)（如DOPC）是否在這些N系列脂質(zhì)的肺靶向遞送中起作用，在保持膽固醇和DMG-PEG2000不變的情況下，用DSPC和DOPE等輔助脂質(zhì)配制了306-N16B。

● 圖S1

如圖S1，LNP制劑使用可電離脂質(zhì)306-N16B與輔助脂質(zhì)DOPE或DSPC也導致蛋白質(zhì)主要在肺中表達，盡管當使用輔助脂質(zhì)DOPC時蛋白質(zhì)產(chǎn)生較少（圖1B）。這些結(jié)果表明，活性類脂質(zhì)（如306-N16B），而不是輔助脂質(zhì)，負責使用N系列LNPs進行肺靶向遞送。

● 圖S2

然后，研究了306-N16B LNP-mRNA復合物的生物分布，以了解觀察到的器官選擇性蛋白表達。通過尾靜脈注射將負載Luc mRNA的LNPs注射到Balb/c小鼠體內(nèi)。注射后4h處死小鼠并取器官，然后提取器官中的306-N16B并用質(zhì)譜定量，發(fā)現(xiàn)306-N16B不僅在肺部檢測到，而且在肝臟和一些脾臟中也檢測到（圖S2），而熒光素酶僅在肺部表達（圖1B）。雖然肝和脾中沒有檢測到蛋白質(zhì)表達的具體機制仍有待闡明，但這些結(jié)果表明LNP器官積累與細胞攝取和蛋白質(zhì)表達之間并不總是存在相關(guān)性。

通過改變N系列LNPs的胺頭結(jié)構(gòu)，可以靶向不同的肺細胞亞群

基于mRNA療法的臨床轉(zhuǎn)化需要將mRNA遞送到特定的器官和細胞類型。肺部可能受到由多個細胞區(qū)室功能失調(diào)引起的許多疾病的影響，包括內(nèi)皮，上皮和免疫細胞。為了鑒定特異性轉(zhuǎn)染的肺細胞亞群，利用基因工程Cre/LoxP Ai14報告小鼠系來實現(xiàn)tdTomato蛋白的細胞類型特異性表達。給Ai14小鼠注射了兩種最有效的肺靶向LNPs（306-N16B和113-N16B）。該實驗以編碼Cre重組酶的Cre mRNA作為mRNA貨物。一旦遞送到細胞中，Cre重組酶移除終止盒，并激活tdTomato熒光信號在編輯細胞中表達（圖3A）。

如圖3 B和C，在306和113-N16B LNP處理小鼠的肺部特異性檢測到紅色tdTomato信號，并且通過使用肺切片的共聚焦成像觀察tdTomato陽性細胞。為了進一步鑒定和定量肺中轉(zhuǎn)染的特定細胞類型，將肺組織處理成單細胞懸液并使用流式細胞術(shù)進行分析。306-N16B LNP對肺內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)染率為33.6%，而上皮細胞為1.5%，巨噬細胞為1.9%（圖3B），表明306-N16B LNP能夠選擇性地將mRNA遞送到肺內(nèi)皮細胞。相比之下，113-N16B LNP優(yōu)先向內(nèi)皮細胞遞送Cre mRNA（占總內(nèi)皮細胞的69.6%），但也遞送至巨噬細胞（18.9%）和上皮細胞（7.3%）（圖3C）。這些發(fā)現(xiàn)表明，通過簡單地調(diào)整N系列LNPs的頭部結(jié)構(gòu)，可以靶向不同的肺細胞群，為與特定肺細胞相關(guān)的肺部疾病的潛在治療應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

●圖3 通過調(diào)整N系列LNPs的頭部結(jié)構(gòu)，可以靶向不同類型的肺細胞。

306-O12B和306-N16B LNP蛋白冠組成蛋白質(zhì)的特性

據(jù)信，納米顆粒（NPs）的外表面在靜脈內(nèi)給藥后不久立即被一層生物分子冠掩蓋，這可以顯著改變NPs的表面性質(zhì)并決定其體內(nèi)命運。NPs表面上特定血漿蛋白的受控吸附可能會選擇性地將NPs引導到特定器官。假設(shè)O系列和N系列LNPs的體內(nèi)器官靶向性（圖4A）的顯著差異可能歸因于其表面形成的血清蛋白（圖4B）。為了驗證這一假設(shè)，鑒定并量化了兩種代表性LNPs（306-O12B和306-N16B）上的蛋白質(zhì)。將這兩種LNPs與小鼠血漿在37°C下孵育1h，并通過離心分離并回收蛋白質(zhì)包被的LNPs，用PBS進行洗滌。然后進行蛋白質(zhì)組學以分析LNPs上蛋白質(zhì)的組成。分別在306-O12B LNP和306-N16B LNP上鑒定并定量了1838種和1088種蛋白質(zhì)。

Venn圖揭示了306-O12B LNP和306-N16B LNP之間的常見和獨特蛋白質(zhì)（圖S3）。在表1中列出了每個LNP的前20種最豐富的冠狀蛋白，這些蛋白可能在蛋白冠中起主導作用。發(fā)現(xiàn)306-O12B LNP和306-N16B LNP在前20名中只有6種共同的蛋白質(zhì)，這支持了假設(shè)，即LNP表面吸附的蛋白質(zhì)可能參與體內(nèi)靶向性。確定ApoE是肝臟冠層中靶向306-O12B LNP的第二主要蛋白質(zhì)組成（圖4C），與先前10.1038/s41565-019-0591-y證明載脂蛋白E（ApoE）介導的LNPs遞送到肝臟的研究一致。相比之下，肺靶向306-N16B LNP冠層中的前三種蛋白質(zhì)是血清白蛋白，纖維蛋白原β鏈和纖維蛋白原γ鏈（圖4D）。據(jù)報道，纖維蛋白原涂層可以改善內(nèi)皮細胞粘附和內(nèi)皮化。O系列或N系列LNPs分別由一種特定蛋白質(zhì)或幾種蛋白質(zhì)的協(xié)同作用決定的蛋白冠介導的肝臟或肺靶向mRNA遞送的潛在機制需要進一步研究。

●圖4 LNPs上形成蛋白冠結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)組學研究。

●圖S3 Venn圖顯示了306-O12B LNP(淺綠色)和306-N16B LNP(淺藍色)上吸附的共同和獨特的蛋白質(zhì)。

根據(jù)分子量（Mw）進一步對前20種蛋白質(zhì)進行了分類（圖4E）。306-O12B LNP的蛋白冠富集在低分子量蛋白質(zhì)中，80%的蛋白質(zhì)具有Mw<60kDa，而306-N16B LNP的蛋白質(zhì)冠中有55%的蛋白質(zhì)＞60kDa。還根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點（pI）對蛋白質(zhì)進行了分類，如圖4F所示，在生理pH 7.4下顯示負電荷（pI < 7）的蛋白質(zhì)的50%和80%分別構(gòu)成306-O12B LNP和306-N16B LNP的蛋白冠。有人建議帶正電荷的NPs更喜歡吸引帶負電荷的蛋白質(zhì)。然而，在該案例中，沒有看到這兩種LNPs的zeta電位有顯著差異，兩種LNPs都顯示出輕微的負表面電荷（表S1），表明表面電荷可能不是影響生物體液中NPs和蛋白質(zhì)之間相互作用的唯一因素。

最后，根據(jù)蛋白質(zhì)的生物學功能對蛋白質(zhì)進行分類（圖4G）。306-O12B LNP和306-N16B LNP富含的蛋白質(zhì)與脂代謝、補體活化、免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)和凝血有關(guān)。然而，應(yīng)該注意的是，除了其他血漿蛋白外，306-O12B LNP的冠層中富集最高的蛋白質(zhì)是參與脂質(zhì)和膽固醇代謝的載脂蛋白（圖4 G），而凝血相關(guān)的冠層蛋白代表306-N16B LNP冠層中最大的部分（圖4 G)。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，在306-O12B LNP和306-N16B LNP上形成的蛋白冠在蛋白質(zhì)組成生物學功能上存在差異，這可能在確定其體內(nèi)組織靶向方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

Highlight

改變脂質(zhì)化合物的連接基團可以改變脂質(zhì)納米顆粒的器官靶向性：O系列（連接基團為酯鍵）靶向肝；N系列（連接基團為酰胺鍵）靶向肺；

調(diào)節(jié)脂質(zhì)化合物的頭部小分子胺的結(jié)構(gòu)，可改變其對特定組織的細胞靶向性；

納米顆粒表面形成的蛋白冠（protein corona）影響脂質(zhì)納米顆粒的器官靶向性；

體內(nèi)基因編輯療法，有望實現(xiàn)長效疾病治療的目的。

來源：TCRshows

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